Респираторная медицина. Руководство (в 2-х томах) - Чучалин А. Г.. Страница 104

type: dkli00087

ПРЯМЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ОБРАЗЦОВ

МЕТОДЫ МИКРОСКОПИИ

Микроскопический метод изучения нативных и окрашенных препаратов, в том числе с использованием меченных флюорохромом специфических антисывороток (антительные диагностикумы), обеспечивает быструю предварительную или окончательную диагностику ИНДП и позволяет судить об адекватности материала (в первую очередь мокроты).

При исследовании мокроты начальный этап - отбор гнойных или опалесцирующих участков и перенос их в стерильную чашку Петри. Интересующая часть образца используется для приготовления влажного или окрашенного по Граму мазка для микроскопии. Дифференциацию слущенных эпителиальных клеток (СЭК), реснитчатых эпителиальных клеток, альвеолярных макрофагов и гистиоцитов проводят под малым увеличением микроскопа (объектив x10). Присутствие большого числа СЭК (>25 в поле зрения) свидетельствует о контаминации микрофлорой ротоглотки. Такой образец не пригоден для посева, и материал следует взять повторно. Преобладание в образце полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПЯЛ), клеток реснитчатого эпителия или альвеолярных макрофагов при отсутствии или незначительном числе СЭК (<10 в поле зрения) свидетельствует о наличии секрета из нижних отделов дыхательного тракта, который подлежит дальнейшему исследованию с помощью иммерсионного объектива при увеличении в 1000 раз и посеву. Диагностический критерий качества мокроты - наличие не менее 25 ПЯЛ и менее 10 СЭК при исследовании в 10 полях зрения под малым увеличением микроскопа (объектив x10). Цитологическая оценка пригодности мокроты важна для бактериального исследования, но не для культуральной индикации МБТ, грибов и вирусов, где перед культивированием производится деконтаминация образцов, используются селективные среды, а обнаружение МБТ, патогенных грибов или вирусных изолятов не вызывает сомнения в их клинической значимости [2].

Под большим увеличением (иммерсионный объектив x100) изучают морфологию бактерий. Чувствительность микроскопического метода при окраске по Граму по разным оценкам варьирует от 35 до 96%, а специфичность - от 12 до 85% [17]. Его диагностическое значение, в основном, ограничивается пневмококковой инфекцией, где совпадение с результатами культуральной диагностики составляет 75% [18].

Эффективность метода для выявления других патогенов у взрослых проблематична. Например, Haemophilus influenzae можно обнаружить в ВДП у здоровых индивидуумов, но гемокультура, как дополнительный диагностический критерий в пользу микроскопического исследования, выделяется редко. Определение в моче антигенов H. influenzae типа В имеет значение в педиатрической практике, но антигенурия может быть следствием вакцинации. У взрослых лишь получение БС инвазивными методами помогает в установлении диагноза. При пневмониях, вызванных H. influenzae, высокую диагностическую ценность имеет исследование ТТА и БАС [19]. Присутствие в образцах большого числа плеоморфных тонких коккобацилл, часто внутри ПЯЛ, достоверно свидетельствует в пользу пневмонии, обусловленной гемофильной палочкой.

Среди других возможных возбудителей ИНДП Moraxella catarrhalis - комменсал ВДП, а носительство Neisseria meningitidis в ротоглотке может варьировать от 10% у взрослого населения до 70% у военнослужащих в закрытых воинских коллективах. Обнаружение в мокроте или ТТА большого числа грамотрицательных диплококков, локализованных внутри и вне ПЯЛ, с высокой вероятностью свидетельствует о возможном участии в этиологии пневмонии морфологически сходных между собой M. catarrhalis или Neisseria spp. [20], что позволяет определить направление дальнейшего культурального исследования.

Проблемы при дифференциации между колонизацией и суперинфекцией возникают с бактериями кишечной группы и псевдомонадами. Обычно грамотрицательные палочки, вызывающие вторичную инфекцию, определяются в значительном числе в мазках мокроты и в ТТА наряду с ПЯЛ, достигая при посеве концентраций 107 - 1010 КОЕ/мл. Однако и у пациентов ОИТ, находящихся на ИВЛ, в дыхательном секрете можно обнаружить до 108 КОЕ/мл без признаков пневмонии [23].

Таким образом, окраска мазков по Граму - важный и необходимый этап исследования мокроты для определения ее пригодности к культуральному исследованию и позволяет быстро обнаружить вероятные бактериальные возбудители пневмонии. Неправильное приготовление мазков и неграмотная интерпретация результатов окраски существенно снижает ценность метода. Изучение ТТА отличается более высокой специфичностью и чувствительностью при индикации микроорганизмов, включая возбудителей анаэробной инфекции.

Для выявления Mycobacterium tuberculosis микроскопические методы при окраске мазков по Цилю - Нильсену и флюоресцентным красителем имеют одинаковую чувствительность (до 50%) и специфичность (до 99%) [24], совпадение результатов микроскопической и культуральной диагностики зависит от тяжести заболевания. Для обнаружения МБТ в световом микроскопе при окраске по Циль - Нильсену необходимо содержание в мокроте не менее 5000 - 10 000 КОЕ/мл. При окраске мазка аурамин-родамином микроскопия становится более продуктивной в рутинных исследованиях, так как за равный промежуток времени в люминесцентном микроскопе при малом увеличении (объектив x25) можно просмотреть больше полей зрения, чем в световом микроскопе под иммерсией (объектив x90).

При диагностике актиномикоза легких материалом для микроскопического исследования служат гной, мокрота, плевральная жидкость, пунктаты закрытых очагов поражения, биопсийный материал. Наиболее подходящие для исследования - твердые зернистые образования, из которых сначала готовят неокрашенные препараты в капле 10% щелочи или смеси спирта с глицерином, затем мазки, окрашенные по Граму и Цилю - Нильсену. Уже при малом увеличении микроскопа видны комочки (друзы) с плотным, темным центром, с лучистыми образованиями по периферии, которые в дальнейшем изучают под большим увеличением микроскопа. Обнаружение друз, мицелия, отдельных веточек и цепочек из спор - ценное подтверждение актиномикотической природы болезни.

Прямая фазово-контрастная микроскопия бронхиального секрета, со смесью 10% раствора калия гидроксида и 10% глицерина, позволяет проводить быструю идентификацию грибов Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans и Aspergillus spp., добавление специальных красителей позволяет улучшить очертания элементов гриба, включая P. jiroveci.

Для обнаружения L egionella pneumophila непосредственно в мокроте, ТТА, БС, биоптатах ткани легкого применяется реакция прямой иммунофлюоресценции (РИФ), чувствительность которой составляет 25 - 66%, специфичность достигает 94% [25]. Для постановки диагноза легионеллезной пневмонии положительный результат РИФ требуется подтвердить любым другим методом: культуральным исследованием респираторных образцов, либо определением антигена в моче, либо серологическими реакциями с сывороткой крови больного.

Для определения антигенов P. jiroveci в индуцированной мокроте и БАС можно использовать РИФ с моноклональными антителами. Преимущество метода - высокая чувствительность (90 - 97%) и быстрое получение результатов, недостатком - техническая сложность исполнения [26].

РИФ позволяет диагностировать инфекции, вызванные респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ), вирусами гриппа А и В, парагриппа, аденовирусами, вирусом кори, что особенно важно в случаях, когда обычная вирусологическая технология трудоемка или недоступна.

МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ

Определение антигенов широко используется для диагностики различных инфекций, что связано с возможностью быстрого получения результатов и идентификации некультивируемых возбудителей. Однако применительно к ИНДП эти методы имеют ряд существенных ограничений. Во-первых, их чувствительность и специфичность, слишком низкие для рутинного использования. Во-вторых, надежность теста в большей степени зависит от того, может ли возбудитель быть комменсалом (как в случае с Streptococcus pneumoniae) или его наличие всегда свидетельствует об инфекции (например, L egionella pneumophila). В-третьих, данные тесты - достаточно дорогие и требуют существенных временных затрат по сравнению с классическими методами [27, 28].